Nach einem ungewöhnlich reibungslosen Countdown hob die US Raumfähre „Endeavour“ am 19.04.2001 um 18:41 UTC von Cape Canaveral ab. Es war bereits die dritte Shuttle Mission des Jahres zur ISS. Wie schon STS-​102  transportierte auch STS-​100  eines der italienischen Multi-​Purpose Logistics Module (MPLM) in der Nutzlastbucht. Diesmal allerdings das zweite Exemplar, „Raffaello“. Außerdem brachte die „Endeavour“ den kanadischen Manipulatorarm Canadarm 2 zur Raumstation. Da der Zeitplan der Mission eng gepackt war, begannen die Missionsspezialisten Chris Hadfield (Kanada) und Scott Parazynski unmittelbar nach Erreichen der Umlaufbahn mit den Vorbereitungen auf ihr erstes Außenbordmanöver. Kommandant Kent Rominger und Pilot Jeffrey Ashby nahmen inzwischen die „Verfolgung“ der ISS auf. Und auch die weiteren Besatzungsmitglieder, John Phillips, Umberto Guidoni (Italien) und Juri Lontschakow (Rußland) begannen mit ihren Vorbereitungen auf die Ankunft an der Internationalen Raumstation. Am 21.04.2001 um 13:59 UTC war es soweit. Die „Endeavour“ koppelte am PMA-​2  des Moduls „Unity“ an. Eine Begrüßung durch die Crew der ISS war zunächst nur über Funk möglich. Denn der Luftdruck im Shuttle mußte während der Vorbereitung auf das erste Außenbordmanöver auf einem anderen Niveau gehalten werden, als in der Raumstation. So wurde die Luftschleuse lediglich genutzt, um einige Güter auszutauschen. Am 22.04.2001 ab 11:45 UTC unternahmen Hadfield und Parazynski dann die erste EVA der Mission. Zuvor war die Palette mit dem gefalteten Canadarm 2 aus der Nutzlastbucht herausgehoben und am „Destiny“ Modul verankert worden. Zu den Aufgaben der beiden Astronauten gehörte es nun, die zahlreichen Transportsicherungen zu entfernen, den Ausleger zu entfalten und mechanisch mit der Station zu verbinden. Sobald auch die elektrische Verbindungen zur ISS hergestellt waren, konnte Susan Helms ihn aus der ISS erstmals in Betrieb nehmen. Nachdem auch noch eine UHF Antenne am „Destiny“ Modul montiert war, kehrten die beiden Missionsspezialisten in die Luftschleuse zurück. Aufenthaltsdauer im freien Raum: 7:10 h. Am nächsten Tag konnten sich die Mannschaften der beiden Raumschiffe dann auch endlich persönlich begrüßen und Versorgungsgüter austauschen. Aufgabe von Missionsspezialist Parazynski war es zudem, das MPLM „Raffaello“ aus der Nutzlastbucht herauszuheben und am „Unity“ Modul anzukoppeln. Schließlich zündete Shuttle Pilot Ashby die Triebwerke der „Endeavour“ für eine Bahnanhebung. Dann mußten die Luken auch schon wieder geschlossen werden, als Hadfield und Parazynski mit den Vorbereitungen auf ihre zweite EVA begannen. Sie verließen die Luftschleuse am 24.04.2001 um 12:34 UTC und begannen damit, weitere Kabelverbindungen zum Manipulatorarm herzustellen. Dabei gab es vorübergehend Kontaktprobleme beim Reserve-​Stromkreis. Einge Steckkontakte mußten gelöst und erneut befestigt werden, bevor ISS Bordingenieurin Helms einen Erfolg melden konnte. Unerwartete Probleme gab es auch bei der Demontage einer nicht mehr benötigten Antenne am „Unity“ Modul. Hadfield bemerkte, daß dabei ein Stecker auseinandergebrochen war. Da nicht erkennbar war, wo die Überreste des Steckers verblieben waren, mußte er einige Abdeckungen am in der Nähe befindlichen Kopplungsadapter entfernen. Die Flugleitung befürchtete nämlich, daß die Reste des Steckers schlimmstenfalls dort eingedrungen waren. Das war glücklicherweise nicht der Fall. Wegen dieser Zusatzarbeiten verlängerte sich die EVA Dauer um rund eine Stunde auf 7:40 h. Die nächsten beiden Flugtage waren für das Ent– und Beladen von „Raffaello“ sowie die Inbetriebnahme des neuen Manipulatorarms der Station reserviert. Anhaltende Computerprobleme verzögerten die Arbeiten aber erheblich. Zeitweise brach bei der Fehlersuche sogar die Energieversorgung im „Destiny“ Modul zusammen. Daraufhin entschied die Flugleitung, die Mission um einen Tag zu verlängern. Da kam es zu einem erneuten Zusammenbruch der Stromversorgung, woraufhin man auf die Notsysteme umschaltete und alle nicht benötigten Gerätschaften deaktivierte. Entgegen der Bedenken der Flugleitung konnte das „Raffaello“ Modul am 27.04.2001 ohne Probleme wieder abgekoppelt und in der Nutzlastbucht der „Endeavour“ verstaut werden. Wäre es bei dem Manöver zu Problemen gekommen, hätte dies rasch zu einer kritischen Situation führen können. Am nächsten Tag konnten die Computerprobleme allmählich überwunden werden und schließlich kam der Canadarm2 erstmals zum Einsatz. ISS Bordingenieur James Voss benutzte ihn nach einer gründlichen Erprobung, um die leere Transportpalette des Manipulatorarms an den Canadarm des Shuttle zu übergeben, der sie dann in der Nutzlastbucht des Shuttle verstaute. Allerdings waren kombinierte Manöver um mehrere Achsen wegen der Computerprobleme dabei noch tabu. Grundsätzlich war der Canadarm2 nun jedoch einsatzbereit. Damit hatte die Besatzung der „Endeavour“ ihre Mission erfüllt. Da mit Sojus TM-​32  bereits das nächste Raumschiff auf dem Weg zur ISS war, blieb nicht viel Zeit für die Verabschiedung. Mit den noch bestehenden Computerproblemen auf der ISS — nur einer von drei Hauptcomputern der Station war einsatzbereit — mußte die ISS Stammbesatzung allein fertigwerden. Am 29.09.2001 wurden die Luken geschlossen und um 17:34 UTC koppelte die „Endeavour“ von der ISS ab. Nach dem Routineumfliegen der Raumstation entfernte sich das Shuttle von der ISS. Am nächsten Tag bereitete sich die Crew auf ihre Rückkehr zur Erde vor. Die Wetterprognose für die nächsten Tage schloß zwar eine Landung in Cape Canaveral aus, doch war die Flugleitung entschlossen, die Crew baldmöglichst zur Erde zurückzuholen. Da der Aufenthalt an der ISS bereits um einen Tag verlängert worden war, wollte man die Ressourcen des Shuttles nicht weiter strapazieren. Also wurde die Cockpit-​Crew instruiert, sich auf eine Landung in Kalifornien vorzubereiten. Am 01.05.2001 wurde das Retromanöver eingeleitet und um 16:12 UTC setzte die „Endeavour“ auf der Runway 22 der Edwards AFB auf. Damit ging nach 285:30 h die Mission „Endeavour“ F-​16  zu Ende.